作者： 林勇
单位： 江西省医药学校
课程
试验十五
周
次
单、双周
授课
班级
教师
林勇
课题
肝素生物检定法
计划
课时
6
教学目的要求
知识目标：1、熟悉肝素的生物学性状与药理作用。
2、熟悉肝素生物检定原理。
技能目标：1、学会标准品溶液和稀释液的制备。
2、学会肝素生物检定法的操作。
3、学会肝素生物效价测定的结果计算和评价。
重点
难点
重点：肝素检定法的操作
难点：肝素效价的计算
方法
讲授、示范、操作
图例
见教学内容
教具
水浴锅、试管、离心机
教学场所
实训楼 分析实验室
时
间
分
配
1、实验室仪容、仪表要求―――――――——————―5分钟
2、清洗实验器材并进行干燥灭菌———————————35分钟
3、供试品溶液和标准品溶液的配制——————————30分钟
4、新鲜兔血的收集和处理——————————————40分钟
5、分组加入标准品、供试品和兔血操作————————40分钟
6、恒温水浴观察凝结情况并记录结果—————————80分钟
7、根据记录结果进行计算和清场———————————10分钟
教学设计
本节课是物品中生物活性的检定方法的第二次课，教学中结合学生的原有知识水平、心理情况的特点进行教学设计。开课由老师点评实验报告，阐述课程学习内容与目标，调动起学生的情绪使他们身心能尽快进入学习状态。在对上节课总结的基础上，带领大家回顾效价的计算。向大家介绍肝素，包括它的性能、功效，介绍其作用机理。在学生对肝素有一定了解 的基础上，讲解肝素检定法的基本操作，再通过实验，让学生动手，从而加深对知识的认知理解，掌握更形象更深刻。课程中期，先以老师做示范，在老师的指导让学生体验观察模仿、相互学习、相互指出错误、操作竞赛等学练方法，完成独立学练过程。课后思考题让学习内容学习得以延续。
实训内容
肝素钠乳膏的效价测定
教学过程
一、新课导入
1、肝素的基础知识
肝素又名肝素钠，由最初取自肝脏而得名，现多是从猪、羊、牛等动物的肠粘膜或肝肺中提取的一种粘多糖硫酸酯。由于本品具有带强负电荷的理化特性，能干扰血凝过程的许多环节，在体内外都有抗凝血作用。其作用机制比较复杂，主要通过与抗凝血酶Ⅲ（AT-Ⅲ）结合，而增强后者对活化的Ⅱ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅺ和Ⅻ凝血因子的抑制作用。其后果涉及阻止血小板凝集和破坏，妨碍凝血激活酶的形成；阻止凝血酶原变为凝血酶；抑制凝血酶，从而妨碍纤维蛋白原变成纤维蛋白。肝素是临床上常用的抗凝血药，主要用于防治各种原因引起的血栓形成与栓塞，如心肌梗塞、肺栓塞、脑血管栓塞、外周静脉血栓、血管手术及各种原因引起的性血管内凝血症等。口服和直肠给药无效，必须注射。
二、教学步骤
一、测定前的标准品、供试品与血浆的制备
(一)标准品溶液的制备
精密称取肝素标准品适量，按高、中、低剂量组（ds1、ds2、ds3）用氯化钠注射液配成3种浓度的稀释液，相邻两浓度的比值（r）应相等；调节剂量使低剂量组各管的平均凝结时间较不加肝素对照管组明显延长。高剂量组各管的平均凝结时间，用新鲜兔血者，以不超过60分钟为宜，其稀释液一般可制成每1 ml中含肝素2~5单位，r为1：0.7左右；用血浆者，以不不超过30分钟为宜，其稀释液一般可制成每1ml中含肝素0.5~1.5单位，r为1：0.85左右。
(二)供试品溶液与稀释液的制备
按供试品的标示量或估计效价（AT），照标准品溶液与稀释液的制备法制成高、中、低（dT1、dT2、dT3）3种浓度的稀释液。相邻两浓度之比值（r）应与标准品相等，供试品与标准品各剂量组的凝结时间应相近。
(三)血浆的制备
迅速收集兔或猪血置预先放有8%枸橼酸钠溶液的容器中，枸橼酸钠溶液与血液容积之比为1：19，边收集边轻轻振摇，混匀，迅速离心约20分钟（离心力不超过1500×g为宜，g为重力常数）。立即吸出血浆，并分成若干份分装于适宜容器内，低温冻结贮存。临用时置37℃±0.5℃ 水浴中融化，用两层纱布或快速滤纸滤过，使用过程中在4~8℃放置。
二、测定法
（一）新鲜兔血 取管径均匀（0.8cm×3.8cm或1.0cm×7.5cm）、清洁干燥的小试管若干支，每管加入一种浓度的标准品或供试品稀释液0.1ml，立即混匀，每种浓度不少于3管，各浓度的试管支数相等。取刚抽出的兔血适量，分别注入小试管内，每管0.9ml,立即混匀，避免产生气泡，并开始计算时间。将小试管置37℃±0.5℃恒温水中，从动物采血时起至小试管放入恒温水浴的时间不得超过3分钟，注意观察并记录试管的凝结时间。效价测定流程如图5-2
ds1管
ds2管
ds3管
dT1管
dT2管
dT3管
0.1ml/管
0.9ml/管
标准品的溶解
供试品的溶解
标准品的稀释
供试品的稀释
标准品的称量
血 浆
供试品的称量
混匀，37℃±0.5℃恒温水浴
管
观察并记录凝结时间
图5-2 肝素效价测定操作流程
(二)血浆 取上述规格的小试管若干支，分别加入血浆一定量，置37℃±0.5℃恒温水浴中预热5~10分钟后，依次每管加入一种浓度的标准品或供试品稀释液及1%氯化钙溶液，每种浓度不得少于3管，各浓度的试管支数相等，血浆、肝素稀释液和氯化钙的加入量分别为0.5ml、0.4ml或0.1ml，或0.8ml、0.1ml或0.1ml，加入氯化钙溶液后，立即混匀，避免产生气，并开始计算时间，注意观察并记录各管凝结时间。将各管凝结时间换算成对数，照生物检定统计法中的量反应平等线测定法计算效价及实验误差。
测定法（1）的可信限率（FL%）不得大于10%。
测定法（2）的可信限率（FL%）不得大于5%。
三、实验结果记录
１．认真观察各管凝结时间，并记录在表5-2中：
用新鲜兔血检定时，取血要快，一般采用动脉取血；血液加入预先加有肝素的小试管时，应防止产生气泡，加血后立即用小玻璃棒混合，各管搅拌要均一。加血次序由高剂量到低剂量，且标准品和供试品管要对应加入血液。水浴的水面一定要高于试管内的液面，防止出现下边凝结，上边不凝结的现象。
终点观察可采用倒转法，即将试管轻轻倾斜90°，血液不流动为终点。开始时，手拿起管子，并用手指轻轻弹管壁，即可见液面颤动，此时可隔2~3观察一次。当液面开始凝固，手指轻弹管壁已不太颤动时，每隔1分钟观察一次。当手指轻弹管壁几乎不再颤动时，0.5分钟观察一次。也可用压板法和测凝棒法。
2．将各管凝结时间换算成对数，照生物检定统计法中的量反应平等线测定法计算效价（AT）、可信限（FL）以及可信限率（FL%）。
四、书写检定报告
五.逐个对学生提问，要求综合评分考核。提问与学生互动回答半课时。其他学生互动，纠正在回答问题上的理解错误，巩固所学知识，进入
六、清场，指导学生正确填写各项记录、表格。半课时。
习题
思考：实验动物一般用几只即可？
答：实验动物一般用6只即可
教学评价与反思
整个教学过程学生基本按预先的教学设计意图有效的完成了教学内容，对知识点及技术动作的掌握都达到了预期目标。
编辑：
审核：
